熒光顯微鏡簡介
熒光顯微鏡介紹
熒光是物質(zhì)吸收給定波長的光并發(fā)射另一波長的光時發(fā)生的現(xiàn)象。熒光發(fā)生于電子，該電子被激發(fā)到更高且更不穩(wěn)定的能量狀態(tài)，弛豫到其基態(tài)并發(fā)出光子。負(fù)責(zé)激發(fā)或?qū)㈦娮右苿拥礁吣芰繝顟B(tài)的光，其波長和能量要比熒光發(fā)射的波長和能量長，而熒光發(fā)射的波長更長，能量更低且顏色不同。
熒光顯微鏡結(jié)合了光學(xué)顯微鏡的放大特性和熒光技術(shù)，該技術(shù)可以激發(fā)和檢測熒光團(tuán)-熒光化合物的發(fā)射。借助熒光顯微鏡，科學(xué)家可以觀察組織內(nèi)特定細(xì)胞類型或細(xì)胞內(nèi)分子的位置。
熒光顯微鏡的原理和組成
熒光顯微鏡的主要組成部分與傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡有很大的重疊。但是，兩個主要區(qū)別是光源的類型和專用濾鏡元件的使用。
熒光顯微鏡需要一個非常強(qiáng)大的光源，例如氙氣或汞弧光燈，如此處所示。水銀弧光燈發(fā)出的光的亮度是大多數(shù)白熾燈的10到100倍，并提供從紫外線到紅外線的各種波長的光。此高功率光源是熒光顯微鏡設(shè)置中zui危險的部分，因?yàn)橹币曃催^濾的光會嚴(yán)重?fù)p壞視網(wǎng)膜，如果燈泡處理不當(dāng)會導(dǎo)致燈泡爆炸。
熒光顯微鏡的基本原理
熒光顯微鏡的原理很簡單。當(dāng)光離開弧光燈時，它被引導(dǎo)通過一個勵磁濾波器，該濾波器選擇激發(fā)波長。
該光被稱為二向色鏡的特殊鏡向樣品反射，該鏡被設(shè)計(jì)為僅反射激發(fā)波長的光。反射光穿過物鏡，然后將其聚焦到熒光樣本上。樣品發(fā)出的光又依次通過物鏡-發(fā)生圖像放大的物鏡-現(xiàn)在通過二向色鏡。
該光被屏障過濾器過濾，屏障過濾器選擇發(fā)射波長并過濾掉來自弧光燈或其他從顯微鏡組件反射回來的光源的污染光。zui終，過濾后的熒光發(fā)射被發(fā)送到檢測器，在此圖像可以被數(shù)字化，或者被傳輸?shù)侥跨R進(jìn)行光學(xué)觀察。
激發(fā)濾光片，二向色鏡和屏障濾光片可以組裝在一起，成為一個稱為濾光片立方的組件。觀察樣品期間可以改變不同的濾光片立方體以改變激發(fā)波長，并且可以使用一系列的隔膜來改變激發(fā)強(qiáng)度。
在進(jìn)行熒光顯微鏡檢查時，熒光團(tuán)與顯微鏡本身一樣重要，并且要成像的熒光團(tuán)的類型決定了所用的激發(fā)波長和所檢測到的發(fā)射波長。激發(fā)波長包含能被熒光團(tuán)吸收并使其轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài)的小范圍能量。激發(fā)后，可能會產(chǎn)生大范圍的發(fā)射或轉(zhuǎn)換回較低的能量狀態(tài)，從而產(chǎn)生發(fā)射光譜。
吸收或激發(fā)曲線的峰值與發(fā)射曲線的峰值之間的差稱為斯托克頻移。該偏移的距離越大，則將兩個不同的波長分開就越容易。此外，濾鏡立方體的組件需要去除任何重疊的光譜，以減少背景并提高圖像質(zhì)量。
熒光團(tuán)長時間處于激發(fā)狀態(tài)會導(dǎo)致其發(fā)生光漂白，這是熒光減弱或丟失的原因。為了減少光漂白，您可以在幻燈片上添加防褪色安裝介質(zhì)，并用指甲油密封邊緣。幻燈片在不成像時也應(yīng)保持在黑暗中。
熒光顯微鏡成像
要開始熒光成像，請打開氙氣或汞燈光源，并使其預(yù)熱15分鐘，以使其達(dá)到恒定的照明度。
接下來，將您的樣品放在舞臺上并將其固定到位。然后，打開顯微鏡的白光源。通過調(diào)節(jié)粗調(diào)和細(xì)調(diào)旋鈕，使用zui低功率的物鏡將樣品聚焦。然后，使用舞臺調(diào)節(jié)旋鈕找到您感興趣的區(qū)域。
接下來，關(guān)閉白光源以及所有不必要的室內(nèi)燈以減少背景。
為要成像的染料選擇正確的濾鏡立方體，然后打開快門以照亮樣品。
zui后，進(jìn)行微調(diào)焦，并將輸出光引導(dǎo)至成像相機(jī)。您可能需要調(diào)整每種使用的不同熒光團(tuán)或熒光染料的曝光時間。但是，比較不同樣品上具有相同染料的特征時，保持曝光時間恒定很重要。
要使同一樣本上的多種染料成像，請更改濾鏡立方體以匹配每個熒光團(tuán)并記錄新圖像。
對樣品中的每種染料成像后，可以疊加并合并各個圖像。
應(yīng)用
許多不同類型的實(shí)驗(yàn)都可以利用熒光顯微鏡檢查，并涉及不同類型的熒光團(tuán)。熒光顯微鏡檢查的zui常見應(yīng)用之一是對已用與熒光化合物連接或“綴合”的抗體標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行成像。在此，使用與alexafluor-488偶聯(lián)的二抗檢測了針對鉤端螺旋體表面蛋白的抗體，該抗體在激發(fā)時發(fā)出綠色熒光。
用熒光突出顯示特定特征的另一種方法是將熒光蛋白（例如綠色熒光蛋白或GFP）的代碼整合到生物體的DNA中。GFP的基因zui初是從水母中分離出來的，可以由培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)或產(chǎn)生，以響應(yīng)特定的觸發(fā)信號或作為特定細(xì)胞類型的一部分，例如該圖像中顯示的腫瘤細(xì)胞
熒光成像的另一個應(yīng)用是熒光斑點(diǎn)顯微鏡技術(shù)，該技術(shù)使用熒光標(biāo)記的大分子裝配體（如此處看到的F-肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)）來研究這種重要細(xì)胞骨架蛋白的運(yùn)動和更新動力學(xué)。
通過有意地對樣品的一小部分進(jìn)行光漂白，以監(jiān)測熒光標(biāo)記分子回到光漂白區(qū)域的擴(kuò)散速率，可以執(zhí)行一種稱為光漂白后熒光恢復(fù)的先進(jìn)技術(shù)，即FRAP。
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